高效液相色譜法檢測飼料中孔雀石綠的方法

孔雀石綠（malachitegreen）又稱為苯胺綠、維多利亞綠或中國(China)綠，是一種具有金屬光澤的綠色晶體。孔雀石綠的化學(xué)官能團三苯沼氣(CH4)是一種致癌物資，且其易在魚體內(nèi)和情況中殘留，存在致突變、致畸和致癌的危險，故我國、美國(United States)、加拿大(Canada)以及歐盟等很多國度均制止其在經(jīng)濟魚類（觀賞魚除外）和人類食用魚中應(yīng)用。魚粉是飼猜中動物卵白的重要起源，含有孔雀石綠及其代謝物的魚粉添加到飼猜中可經(jīng)由進程食品鏈要挾到人類健康。
    我所現(xiàn)采用NY/T 1756-2009標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用深圳普分科技有限公司高效液相色譜法（HPLC）對飼料中孔雀石綠進行測定，本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料、魚粉中孔雀石綠和無色孔雀石綠含量的測定。液相色譜法孔雀石綠和無色孔雀石綠的定量限均為 10μg/kg；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的定量限均為 1.0 μg/kg。現(xiàn)將該方法簡要介紹如下：
    1.原理 以乙腈-乙酸鈉緩沖溶液提取樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠，提取液經(jīng)過二氯甲烷液液萃取，再經(jīng)固相萃取柱凈化，用接有二氧化鉛柱的氰基柱進行高效液相色譜分離，紫外可見光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。
    2. 分析步驟
    2.1 提取 稱取飼料樣品約 5g (**到 0.001g) ，置于100ml離心管中，依次加入1.5ml鹽酸羥胺溶液、2ml對甲苯磺酸溶液、5ml乙酸鈉緩沖溶液和 20 ml乙腈，加入約2g 酸性氧化鋁，振蕩2min，超聲30 min，4 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至250 ml分液漏斗中，向離心管中再次加入20 ml乙腈，振搖2 min，4000 r/min 離心5 min，合并上清液至分液漏斗中。 
    2.2 液液萃取 加入50ml氯化鈉溶液、50ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層。用蒸發(fā)瓶收集下層液體后，在分液漏斗再次加入 20ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層，收集下層液體于同一蒸發(fā)瓶。將收集液35℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(注意：開始時溫度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5 ml，乙腈溶解殘渣，備用。
    2.3 凈化
    2.3.1 固相萃取柱的活化 按中性氧化鋁柱在上、PRS 柱在下的順序?qū)芍?lián)，使用前用 5ml乙腈預(yù)洗兩柱。
    2.3.2上樣 將2.3.1的樣液緩慢轉(zhuǎn)移到中性氧化鋁柱內(nèi),在抽真空情況下過柱(保持流速 1 ml／min) 。再用5ml乙腈洗滌蒸發(fā)瓶2次，洗滌液均轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，*后用 5 ml乙腈洗滌小柱。
    2.3.3洗脫收集 棄去中性氧化鋁柱，用乙腈-乙酸鈉緩沖溶液2ml、鹽酸羥胺甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，過膜(孔徑 0.45μm)，上機測定。
    2.4樣品測定
    2.4.1色譜條件 
    色譜柱：氰基柱，250 mm ×4.6 mm，柱后氧化鉛柱：35 mm×4.6 mm。 流動相：乙腈＋乙酸鈉緩沖溶液＝60＋40 (v＋v) ；
    流速：1.0 ml/min 。 
    柱溫：室溫。 
    進樣量：50 μl。 
    檢測波長：600 nm。
    2.4.2定量測定 按高效液相色譜儀說明書調(diào)整儀器操作參數(shù)。向液相色譜儀中注入孔雀石綠和無色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液，得到色譜峰面積響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量。

1 氯霉素類**概述
氯霉素類**是應(yīng)用廣泛的廣譜***，常用于動物各種傳染性**的**中，對各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品各種傳染性**的控制和**起重要作用。氯霉素*初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取制得，現(xiàn)在基本使用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)。其性質(zhì)穩(wěn)定，在干燥狀態(tài)下可保存藥效達2年以上，易溶于有機溶劑，25 ℃時100 ml水中僅溶解25 mg。水溶液呈中性，在酸性和中性溶液中較穩(wěn)定，遇堿類易分解失效。其合成品具有**光性，也稱左霉素。
2 氯霉素殘留對人類健康的危害
2.1 骨髓造血機能紊亂
氯霉素對骨髓造血機能有抑制作用，可引起血小板減少性紫癜、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、溶血性等，多數(shù)在長期或多次用藥的過程中發(fā)生。
2.2 對早產(chǎn)兒和新生兒的毒性
在早產(chǎn)兒和新生兒肝內(nèi)有些酶系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，葡萄糖醛酸結(jié)合的能力較差，因此影響氯霉素在肝中的**作用；此外，腎臟排泄能力亦較弱，能招致**蓄積中毒。
2.3 胃腸道癥狀、口部癥狀
胃腸道反應(yīng)主要有腹脹、腹瀉、食欲減退，惡心、嘔吐則少見。口部癥狀如口腔粘膜充血、疼痛、糜爛、口角炎和舌炎等。
2.4 其它**反應(yīng)
可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重**。有時發(fā)生中毒性精神病，主要表現(xiàn)為幻視、幻聽、定向力喪失、精神失常等。
3 氯霉素殘留對我國動物產(chǎn)品出口的影響
氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。
幾年來，我國出口到歐盟、美國等地區(qū)的水產(chǎn)品、蜂蜜等多次因為氯霉素超標(biāo)被限制，損失達到數(shù)十億美元。
4 氯霉素殘留檢測方法
近年來各種關(guān)于氯霉素殘留的檢測方法不斷涌現(xiàn)，大致可分為三大類：**類是生物測定法，**類是理化分析法，第三類是兼有生物和化學(xué)的酶聯(lián)**檢測法。
4.1 篩選檢驗方法
在實際工作中，不可能也沒必要對所有動物性水產(chǎn)品進行各種復(fù)雜、昂貴且耗時的分析檢測。為能快速確定動物食品中是否有氯霉素殘留，通常做法是遵循一定程序，對被測產(chǎn)品進行取樣，按規(guī)范要求對樣品進行篩選檢驗，對篩選為陽性的樣品再用更**的方法進行定量鑒定。
4.1.1 微生物法
在快速篩選檢驗程序中，微生物法非常有效，這類方法簡單、費用少、速度快，因而廣泛用于動物性食品獸藥殘留的初篩。
4.1.1.1 棉簽法
棉簽法又稱現(xiàn)場拭子法，是檢測動物體中***殘留的現(xiàn)場試驗方法。
該方法是用棉簽（拭子）采取動物體內(nèi)的組織液，然后將其放置于涂滿枯草桿菌的培養(yǎng)基中保溫過夜。觀察是否在拭子周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)，若有，即表明組織液中有***存在。如果該動物僅用氯霉素進行過**，則可以認(rèn)為該組織中存在氯霉素殘留。此方法在幾分鐘內(nèi)即可完成取樣操作，16～18 h即可獲得結(jié)果，是簡便易行而又有一定準(zhǔn)確性的檢測方法，比較適合基層現(xiàn)場篩選檢測。但是該檢測法靈敏度較差，檢出限較高，多在μg/g級，特異性差，一般***類**都有此類反應(yīng)，而且不能定量。
4.1.1.2 杯碟法
樣品經(jīng)處理后，注入牛津杯中，與含菌液的檢定平板貼合，培養(yǎng)后，根據(jù)抑菌圈有無及大小判定結(jié)果。采用不同的試驗菌種，可檢測不同的***。此法檢出限為0.25 μg/g。
這種方法與棉簽法相比，靈敏度高，能夠排除一定的干擾，但要進一步提高靈敏度很困難。
4.1.2 **分析方法
**分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)。**反應(yīng)具有很高的選擇性和靈敏性，因此，**分析技術(shù)無論作為獸藥殘留分析的檢測手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。作為相對獨立的檢測方法，即基于競爭結(jié)合分析原理的**測定法，包括酶聯(lián)**吸附測定（ELISA）、放射**測定（RIA）、固相**傳感器等。
目前使用*普遍的酶聯(lián)**法（ELISA），具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點，是目前*理想的殘留篩選性分析方法之一。
ELISA是基于抗原和抗體反應(yīng)而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激機體產(chǎn)生抗體。要使半抗原性物質(zhì)具有**原性,就需使其與大分子載體物質(zhì)(蛋白質(zhì))相結(jié)合制備人工抗原,而后將其作為抗原進行使用,動物體內(nèi)即可產(chǎn)生相應(yīng)特異性的抗氯霉素的抗體,在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)**競爭法測定氯霉素含量。
此種方法靈敏度高，檢測下限可達0.05 μg/kg，重現(xiàn)性好，回收率高，在1 μg/kg的添加水平下，回收率可達107%～113%。
酶聯(lián)**法的缺點在于影響因素較多,易出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果;抗體批次不同,測定結(jié)果也會出現(xiàn)差異。
4.2 定量確認(rèn)方法
4.2.1 高效液相色譜法
高效液相色譜法檢測氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法，此法重復(fù)性好、假陽性少，可以進行定量鑒定，但檢出限較高，為5～10 μg/kg，回收率偏低。因為動物體內(nèi)成分復(fù)雜，一些雜質(zhì)干擾測定，應(yīng)用該法檢測時，對于樣品預(yù)處理必須仔細(xì)謹(jǐn)慎，以提高測定準(zhǔn)確性和靈敏度。
4.2.2 氣相色譜法
目前較常用的氯霉素確證方法是氣相色譜法,該方法的特點是高分離效能、高選擇性、高靈敏度、檢出限低、快速、應(yīng)用廣,還可用于制備高純物質(zhì)。它可以對于分配系數(shù)相差很近的組分進行分離,從而分離出極為復(fù)雜的混合物。檢出限一般為μg/kg級,常用于*****殘留的檢測。但是大多數(shù)獸藥極性或沸點偏高,需繁瑣的衍生化步聚,因而限制了氣相色譜法的應(yīng)用。
飼料中氯霉素含量的檢測目前采用氣相色譜法。該方法先將配合飼料用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮氣吹去乙酸乙酯后，殘渣用甲醇/氯化鈉溶液溶解，用正己烷液－液萃取除去油脂及脂溶物，氯霉素再用乙酸乙酯提取、吹干，C18小柱凈化，經(jīng)衍生劑衍生后用配有電子捕獲檢測器的氣相色譜檢測。氣相色譜條件如下。
載氣：氮氣1.5 ml/min；補充氣：氮氣25 ml/min；分流比：1：10。溫度：氣化室280 ℃；檢測器300 ℃；柱箱230 ℃。
在上述儀器條件下，注入標(biāo)準(zhǔn)工作液1 μl，調(diào)整試樣定容體積使試樣溶液中氯霉素的峰值與標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素峰值相近，以保留時間和峰值的比較對氯霉素進行定量計算。重復(fù)性：兩個平行測定的結(jié)果相對偏差不得大于5％。回收率：添加量在0.01 mg/kg時，回收率在90%~105%。該方法的*低檢出限為0.005 mg/kg。
5 結(jié)論
總的來說，基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的**學(xué)測定方法靈敏度較高，特異性強，試樣預(yù)處理簡單，分析時間短。近幾年酶聯(lián)**法得到了很大的發(fā)展,假陽性率明顯降低,而且適應(yīng)廣泛。目前在肉類、魚蝦、蛋品、尿液、血清、牛奶、蜂蜜及飼料中都用酶聯(lián)**法來做氯霉素檢測的篩選。
國際上公認(rèn)的定量確認(rèn)方法仍是理化分析法，主要是氣相色譜法和液相色譜法，這兩種方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，假陽性少，缺點是樣品前處理過程復(fù)雜、儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢。二者相比較，由于HPLC檢出限較高，已逐漸不能滿足發(fā)達國家對檢測方法檢出限的要求。聯(lián)用技術(shù)出現(xiàn)后，LC-MS由于靈敏度高,檢出限更低,結(jié)果**可靠,在氯霉素殘留的分析中正逐漸代替單一的色譜技術(shù)。